Designing and testing red light-activated optogenetic tool for controlling gene expression in mammalian cells - Sutinen, Satu (2024)
Optogenetiikka tutkii ja ohjaa soluja valoherkkien proteiinien, valoreseptorien avulla. Eräs valoreseptorityyppi on bakteerifytokromit, jotka aistivat punaista ja kaukopunaista valoa. Luonnossa bakteerifytokromit ovat usein valoherkkiä histidiinikinaaseja (HK) ja toimivat osana kaksikomponenttijärjestelmää, jonka avulla bakteerit aistivat ympäristön signaaleja ja säätelevät soluvasteita, kuten geeniekspressiota. Tämäntyyppisiä valoreseptoreja ja signalointireittejä voidaan hyödyntää optogenetiikassa säätelemällä niiden avulla geeniekspressiota kohdeorganismin soluissa. Tässä Pro Gradu -työssä tuotettiin uusi, punaisella valolla aktivoituva optogeneettinen työkalu, mDERusk, geeniexpression ohjaamiseen nisäkässoluissa. mDERusk hyödyntää bakteerifytokromin valoa aistivaa osaa kimeerisessä HK komponentissa osana kaksikomponenttijärjestelmää, jolla säädellään kohdegeenin transkriptiota. Työkalu valmistettin kääntämällä olemassa olevan nisäkässolujen geeniekpressiota ohjaavaan optogeneettisen mREDusk työkalun toiminta pimeässä aktiivisesta punaisen valon avulla aktivoitavaksi, jotta saavutetaan tarkempi spatio-temporaalinen ohjailtavuus. Aktiivisuuden kääntyminen saatiin aikaan muokkaamalla valoa aistivan osan ja HKn välistä linkkerialuetta niin, että kimeerisen HKn kinaasiaktiivisuus ja valovaste muuttuivat käänteisiksi. Mutatoitu työkalu kloonattiin Gibson assembly -menetelmällä ja tuotettiin Escherichia coli -bakteereissa. Työkalun toimintaa tutkittiin HEK293 -soluissa kvantifioimalla luminesoivan reportterigeenin ilmentyminen indusoivan punaisen valon alla ja pimeässä inkuboiduissa soluissa, joissa ilmentyminen inhiboituu. Luminesenssimittauksen tulokset osoittivat, että valosta riippuvaisen kinaasiaktiivisuuden kääntäminen onnistui ja punaisen valon alla havaittiin korkeampi reportteriproteiinin tuottuminen. Optimoimalla työkalun toimintaa edelleen, tämän tyyppisiä työkaluja voidaan käyttää esimerkiksi uuden tyyppisten biolääketieteellisten sovellusten kehittämiseen.