IHN- ja VHS-virusten RT-qPCR-testimenetelmän käyttöönotto sekä konsentrointimenetelmien vertailu - Nieminen, Janita (2023)
Kiertovesiviljely (RAS) on vedenkäytöltään tehokas ja ekologinen kalanviljelymenetelmä, joka mahdollistaa vesiviljelyn myös alueilla, joissa veden saatavuus on rajallista. Kalojen patogeenit aiheuttavat kuitenkin haasteita vesiviljelyssä, erityisesti virukset, kuten IHNV (tarttuva vertamuodostavan kudoksen kuolio -virus) ja VHSV (virusperäinen verenvuotoseptikemia -virus), joita vastaan ei ole hoitoa tai rokotetta. Kiertovesilaitokseen päätyessään virus voi levitä nopeasti koko laitokseen, jolloin tyhjennettävän ja desinfioitavan laitoksen kokemat tappiot ovat merkittävät. Nykyiset testimenetelmät eivät aina tunnista piilevää infektiota, minkä vuoksi säännöllinen tuontikalojen ja -mädin testaaminen on tärkeää virusten leviämisen estämiseksi. Tässä työssä optimoitiin RT-qPCR-testimenetelmää (kvantitatiivinen käänteiskopiointipolymeraasi-ketjureaktio) IHN- ja VHS-virusten havainnointiin ja vertailtiin virusten konsentrointimenetelmiä. Työssä tarkasteltiin myös positiivisen kontrollin lisäämistä RT-qPCR-reaktioon (multiplex-PCR), sillä kliinisessä testauksessa menetelmää käytetään usein varmistamaan testin toimivuus. Työssä testattiin ultrasuodatusta, polyetyleeniglykolisaostusta (PEG-saostus), kylmäkuivausta ja InnuPrep-helmiä, jotka on valmistettu vettä sitovasta polymeeristä. Lisäksi tarkasteltiin IHNV-infektoituneesta RAS-laitoksesta otettuja vesinäytteitä ja kokeiltiin kehitetyn testin toimivuutta näytteillä. RT-qPCR-testistä saatiin tarkka, ja testillä pystyttiin havaitsemaan 400 µl:n näytteestä noin kolme viruspartikkelia. Konsentrointimenetelmistä PEG-saostus ja ultrasuodatus kasvattivat näytteen konsentraatiota hieman, ja ultrasuodatus valittiin menetelmän nopeuden ja yksinkertaisuuden vuoksi RAS-laitokselta saatujen näytteiden käsittelyyn. Kumpikaan menetelmistä ei kuitenkaan kasvattanut näytteen konsentraatiota merkitsevästi. Kahdessa RAS-laitokselta saadussa vesinäytteessä havaittiin pieniä määriä IHN-virusta, mutta testituloksen varmistamiseksi PCR-tuote olisi tullut sekvensoida. Loput seitsemän näytettä olivat negatiivisia viruksen suhteen. Ultrasuodatuksen konsentrointitehokkuutta tarkasteltiin kalan RNA:n kautta RAS-näytteistä, jolloin pitoisuutta onnistuttiin kasvattamaan jopa 31-kertaiseksi. Työn tuloksia voidaan mahdollisesti hyödyntää testaamisen nopeuttamisessa kalanviljelylaitoksilla, sillä kehitetty testi kaikkine vaiheineen vaatii vain noin kuusi tuntia. Tämä on huomattavasti tällä hetkellä käytössä olevaa soluviljelytestiä nopeampi, jonka tulosten saamiseen saattaa kulua jopa 14 vuorokautta.