The effects of photosensory module components for phytochrome activity and spectroscopy - Vanhatalo, Roosa (2023)
Bakteerifytokromit voivat säädellä isäntäsolun sisäistä metaboliaa valo-olosuhteista riippuen. Tämän mahdollistaa se, että fytokromit voivat toimia osana kaksikomponenttijärjestelmiä, jotka voivat puolestaan säädellä geenien ilmentämistä soluissa. Yhdistettäessä fytokromien valoa aistivat ominaisuudet ja kaksikomponenttijärjestelmien säätelyominaisuudet on mahdollista kehittää optogeneettisiä sovelluksia lääketieteellisistä hoidoista aina biomateriaalien tuotantoon. pREDusk on optogeneettinen työkalu, jota voidaan käyttää Escherichia coli bakteerissa punaista fluoresoivan reportteriproteiinin geenin ilmentämisen säätelyyn. pREDuskin valoa aistiva osa on kanonisen Deinococcus radiodurans bakteerifytokromin valoa aistiva moduuli, jota voidaan kontrolloida punaisen ja kaukopunaisen valon avulla. Tämä pro gradu tutkielma keskittyy pREDusk työkalun toiminnallisuuden muuttamiseen. Tällä hetkellä punainen valo vaimentaa geenin ilmentämistä ja tutkimuksen tarkoituksena oli sen sijaan aktivoida geenin ilmentäminen kaukopunaisen valon avulla. Muutosta yritettiin hyödyntämällä kahden eri bathyfytokromin valoa aistivaa moduulia, sillä nämä fytokromit reagoivat kaukopunaiseen valoon punaisen valon sijasta. Vaihdokset sisälsivät kaksi koko valoa aistivan moduulin vaihdosta sekä kaksi varianttia, joissa vain ARM-osa valoa aistivasta moduulista vaihdettiin. Tutkimus toteutettiin puhdistamalla muunnellut proteiinit ja tutkimalla niiden entsymaattista aktiivisuutta. Lisäksi varianttien spektroskopisia ominaisuuksia tarkasteltiin UV-Vis ja FTIR spektroskopioiden avulla. Lopuksi pREDusk varianttien geenin ilmentämistä tutkittiin in vivo. Työn tuloksena kolme neljästä proteiinivariantista saatiin puhdistettua. Variantit, joiden ARM osa oli vaihdettu, olivat valosykliltään kanonisia, mutta kun koko valoa aistiva osa vaihdettiin, oli fotosykli käänteinen ja täten bathyfytokromeille tyypillinen. Variantit, joissa vain ARM-osa oli vaihdettu toimivat kuten alkuperäinen työkalu. Puolestaan variantteja, joiden koko valoa aistiva osa oli vaihdettu, ei muutosten jälkeen voitu enää säädellä valolla. Huomionarvoista on, että kaikki puhdistetut proteiinit vaihtuivat kahden valosta aktivoituvan tilan välillä, mikä tarkoitti, että vaihdokset olivat onnistuneita vaikkakaan niiden avulla ei saatu muutettua pREDuskia valolla aktivoitavaksi. Työn löydösten perusteella voidaan pREDusk työkalun kehittämiseksi tulevaisuudessa kokeilla uudenlaisia muutoksia.