Verifying the presence of voltage gated sodium channels in retinal pigment epithelium - Hurskainen, Elina (2020)
Verkkokalvon pigmenttiepiteeli (eng. retinal pigment epithelium eli RPE) on välttämätön kudos näkökyvylle. RPE toimii esteenä verenkierron ja verkkokalvon välillä, huoltaa valoreseptorisoluja mm. kuljettamalla ravinteita ja absorboimalla haitallista, siroavaa valoa, sekä avustaa näköaistimuksessa. RPE:n toiminnan heikentyminen saattaa johtaa verkkokalvon rappeumaan sekä lopulta näkökyvyn menettämiseen. Ionikanavien rooli on merkittävä verkkokalvon pigmenttiepiteelin normaalille toiminalle. Tässä työssä tutkittiin RPE:n jänniteherkkiä natriumkanavia (eng. voltage gated sodium channels eli NaV); tavoitteena oli vahvistaa erilaisten jänniteherkkien natriumkanavien alayksiköiden esiintyminen verkkokalvon pigmenttiepiteelissä kuvantamisen keinoin sekä eristämällä niitä RPE-soluista ja todentaa ne Western blot -menetelmällä. Aluksi kaikki yhdeksän NaV –alayksikköä värjättiin sopivilla vasta-aineilla ja kuvattiin konfokaalimikroskoopilla. Ne alayksiköt, jotka havaittiin mikroskoopilla, oli määrä eristää RPE-soluista ja edelleen tutkia Western blot –menetelmän avulla. Ainoastaan NaV1.4, NaV1.5, NaV1.6 ja NaV1.8 voitiin luotettavasti havaita vasta-aineleimatuista solunäytteistä mikroskoopilla. Nämä em. jänniteherkän natriumkanavan alayksiköt valittiin siis jatkokäsittelyihin. Ennen varsinaista eristämistä ja NaV-alayksiköiden olemassaolon vahvistamista, sopivin kalvoproteiinien eristysmenetelmä sekä tähän tarkoitukseen soveltuva Western blot –protokolla oli testattava ja optimoitava. NaV-proteiinien eristyksessä paras saanto saatiin radioimmunosaostuksen määrityspuskuri (RIPA), proteaasi-inhibiittoreiden ja etyleenidiamiinitetraetikkahapon (EDTA) yhdistelmällä. Eristetyt kalvoproteiinit eroteltiin toisista proteiineista SDS- geelielektroforeesin avulla, siirrettiin sähkövirran avulla nitroselluloosakalvolle ja lopuksi värjättiin sopivilla vasta-aineilla. Tutkimuksissa varmistui edelleen, että RPE solut selvästi ilmentävät NaV1.4, NaV1.5 ja NaV1.6 alayksiköitä. Tulokset viittasivat vahvasti siihen, että RPE ilmentäisi myös alayksikköä 1.8, mutta tämän kohdalla Western blot –tulokset eivät olleet yhtä selkeitä kuin muilla alayksiköillä. NaV1.8 luotettava todentaminen vaatii siis vielä työtä ja mahdollisesti protokollien uudelleen optimointia.