blaTEM1-C- ja blaTEM-52-B-antibioottiresistenssigeenien sammuttaminen CRISPR-Cas9-systeemillä - Eklund, Tiia; Elomaa, Hanna (2018)
Bakteeri-infektiot hoidetaan nykyään pääasiassa antibiooteilla. Antibioottien käytön aiheuttama valintapaine on johtanut antibioottiresistenttien bakteereiden runsastumiseen, mikä hankaloittaa infektioiden hoitoa. Antibioottiresistenssi onkin maailmanlaajuinen kasvava ongelma. β-laktamaasit ovat entsyymejä, jotka hajottavat β-laktaamirenkaan estäen näin β-laktaami-antibiootin toiminnan. β-laktaami-antibiootit, kuten penisilliinit ja kefalosporiinit, ovat yleisesti käytettyjä antibiootteja, joiden käyttö on aiheuttanut β-laktamaaseja tuottavien laajakirjoisten β-laktamaasibakteerien (ESBL, engl. extended spectrum β-lactamase) yleistymistä. ESBL-bakteerit tuottavat β-laktamaaseja, jotka antavat laajakirjoisen resistenssin useita β-laktaameja vastaan. CRISPR-Cas9-systeemi on alun perin bakteerien luonnollinen puolustusmekanismi vierasta DNA:ta vastaan. CRISPR-Cas9-systeemiä hyödynnetään geenien katkaisemisessa targetoimalla kohdegeeni sille komplementaarisen crRNA-sekvenssin (engl. CRISPR RNA) avulla. Kohdegeeni katkaistaan Cas9-entsyymin avulla, jolloin geenin transkriptio estyy. Tässä työssä oli tavoitteena katkaista pEC3- ja pEC15-plasmideissa olevat blaTEM-1C- ja blaTEM-52B-antibioottiresistenssigeenit CRISPR-Cas9-systeemillä. Kohdegeenit tuottavat ampisilliinia hajottavia TEM-tyypin β-laktamaaseja ja niiden sekvenssit eroavat toisistaan muutaman aminohapon osalta. Tavoitteena oli tutkia, kuinka hyvin TEM-entsyymien konservoitunutta kohtaa targetoivaksi suunniteltu crRNA-sekvenssi toimii. E. coli BL21 Gold (pEC3)- ja BL21 Gold (pEC15)-bakteerikantoihin transformoitiin CRISPR-Cas9-systeemin sisältävä crRNA-plasmidi. Systeemin toimiessa Cas9-entsyymi pilkkoi resistenssigeenin. Kontrollisoluihin transformoitiin kontrolliplasmidi, josta puuttui crRNA-sekvenssi. Systeemin tehokkuutta arvioitiin vertaamalla crRNA:n sisältävien solujen ja kontrollisolujen bakteerimääriä antibioottialtistuksen jälkeen. CRISPR-Cas9-systeemin crRNA:lla kohdennettiin hyvin molempia blaTEM-1C- ja blaTEM-52B-resistenssigeenejä. Solut menettivät ampisilliiniresistenssin ja kuolivat ampisilliiniselektiomaljalla. blaTEM-52B-resistenssigeenin katkaisemisessa saavutettiin hieman parempi tulos kuin blaTEM-1C-resistenssigeenin katkaisemisessa, sillä pEC3-linjan solumäärä laski 102 cfu/ml ja pEC15-linjan 103 cfu/ml. Pesäke-PCR:llä ja agaroosigeelielektroforeesilla (AGE, engl. agarose gel electrophoresis) tarkistettiin, oliko crRNA pysynyt eloonjääneissä transformoiduissa soluissa. Tuloksista huomattiin, että suurimmasta osasta bakteereista crRNA oli kadonnut mahdollisesti jonkun mutaation seurauksena. Näytteissä, joissa crRNA oli tallella, CRISPR-Cas9-systeemi ei ollut jostain muusta syystä kuin puuttuvan crRNA:n vuoksi toiminut. Vielä tarvitaan lisätutkimusta, jotta voidaan selvittää minkä vuoksi käytetyn crRNA:n avulla ei saatu poistettua ampisilliiniresistenttiyttä kokonaan bakteerikasvustoissa.