Metabolomiikka massaspektrometrialla - Vähätalo, Sara (2018)
Tässä Pro gradu -tutkielmassa käsitellään erilaisten organismien aineenvaihdunnan eli metabolian tutkimusta keskittyen erityisesti nisäkkäille tyypilliseen soluhengitykseen ja haaraketjuisten aminohappojen aineenvaihduntaan. Haaraketjuisilla aminohapoilla on mekanismiltaan vielä tuntematon yhteys lihaskasvuun ja rasvahappojen lisääntyneeseen aineenvaihduntaan. Kirjallisessa osassa tarkastellaan ravinnon makroravintoaineiden ja soluhengityksen yhteyttä, haaraketjuisten aminohappojen vaikutusta fyysiseen harjoitteluun, rasvahappoaineenvaihduntaan ja aineenvaihduntareitteihin Kainulainen et. al esittämän mallin mukaisesti. Tätä ehdotettua rasvahappojen hapettumisen ja haaraketjuisten aminohappojen katabolian välistä yhteyttä on tarkoitus tutkia rotista, joilla on säädelty ruokavalio, mutta tutkimusta tullaan tekemään myös ihmissoluista. Aineenvaihduntareittien tutkimus tehdään nestekromatografia-massaspektrometria-menetelmällä (LC-MS), jonka kehittämistä varten tutkielman kokeellisessa osassa tehtiin kiinnostuksen kohteina olevien yhdisteiden ominaisuuksia kartoittavia massaspektrometrisia mittauksia. Kirjallisessa osuudessa perehdytään nestekromatografia- ja kaasukromatografia-massaspektrometria-menetelmien ominaisuuksiin ja kehitykseen nimenomaan metabolomiikan näkökulmasta, mihin kuuluu näytteen esikäsittely, laitteiston ominaisuuksien säätäminen huippuunsa, käytettyjen liuottimien optimointi, niiden sopivien suhteiden löytäminen ja tulosten vertailu. Nestekromatografiasta, kaasukromatografiasta ja massaspektrometriasta esitetään teoreettiset perusteet ja vertaillaan niiden etuja metaboliittianalyysissä. Pro gradu -tutkielman kokeellinen osuus jakautui lopulta kahteen osaan: metaboliittianalyysiä varten tehtävään massaspektrometriseen kartoitukseen ja kukurbit[n]uriilien (n = 6, 7, 8) (CB[n]) ja (2, 3-diatsabisyklo[2.2.2]okt-2-en-1-yyli)metyyliamiini-vierasmolekyylin vuorovaikutuksen massaspektrometriseen tutkimukseen. Metaboliittien massaspektrometrisissa kokeissa havaittiin odotetusti negatiivisen polarisaation spektreissä selkeästi tunnistettavat piikit ja voimakkaammat intensiteetit lähes kaikille tutkittaville yhdísteille verrattuna positiivisen polarisaation spektreihin. Suurin osa tutkimukseen kuuluvista metaboliiteista oli poolisia ja sisälsivät karboksyylihapporyhmän. Ainoastaan oksaloetikkahappoa ei onnistuttu analysoimaan massaspektrometrisesti. Kaikista muista metaboliiteista eristettiin [M-H]- -ioni, jolle tehtiin törmäysaktivointikokeet. Törmäysaktivointikokeiden perusteella LC-MS-analyysiin saadaan lisää luotettavuutta ja niistä saatavan informaation pohjalta isobaariset yhdisteet pystytään erottamaan. Kukurbituriilien massaspektrometrisissa analyyseissä tarkkailtiin vapaan atsoalkaanivieraan hajoamista ja verrattiin sitä CB[n]:n ja atsoalkaanin komplekseissa tapahtuvaan hajoamiseen. Analysointi tehtiin happamissa olosuhteissa. Analyyseissä havaittiin atsoalkaanin pilkkoutuvan eri tavoin isäntämolekyyliin sitoutuneena verrattuna vapaan atsoalkaanimolekyylin pilkkoutumiseen. Monimuotoisimmat vuorovaikutukset ja pilkkoutumiset havaittiin CB[7]:n ja atsoalkaanin kompleksien pilkkoutumisessa. CB[6] on onkaloltaan liian pieni sitomaan atsoalkaania sisäänsä ja CB[8]:n onkalo on niin suuri, että vieraana oleva atsoalkaani irtoaa siitä helpommin kuin CB[7]:n onkalosta, joten pilkkoutumista havaitaan vähemmän, kuin CB[7]:n ja atsoalkaanin komplekseissa.