The effect of PLC-inhibitor on echovirus 1 internalization probed with fluorescently labeled echovirus 1 - Myllynen, Mira (2014)
Echovirus 1 (EV1) kuuluu Pikornavirusperheeseen ja tarkemmin luokiteltuna Enterovirusten sukuun. EV1 on pieni ja vaipaton RNA-virus, jonka proteiinikuori koostuu neljästä proteiinista VP1-VP4. Infektion on osoitettu alkavan, kun EV1 tarttuu α2β1-integriiniin solun pinnalla, jonka jälkeen virus otetaan solun sisään kaveoliinivälitteistä endosytoosia sekä makropinosytoosia muistuttavalla mekanismilla. Toisaalta sitä, kuinka virus avautuu sekä vapauttaa RNA:nsa, ei vielä tarkalleen tiedetä. Tässä tutkimuksessa EV1 puhdistettiin ensin sakkaroosigradientilla, jonka jälkeen virus leimattiin fluoresoivalla amiinireaktiivisella värillä. Tulokset osoittivat, että leimauksen onnistumiseksi tarvitaan suhteellisen vähäinen leimamäärä, ja että vähäinen leimamäärä riittää fluoresenssin havaitsemiseksi sekä on tärkeä viruksen infektiivisyyden säilyttämiseksi. Leimattua EV1:stä käytettiin solukokeissa, joissa Fosfolipaasi C inhibiittoria (PLC-inhibiittori) käytettiin viruksen endosytoosin estämiseen, jolloin asettamamme hypoteesin mukaan endosytoosia ei tapahdu, vaan virus jää solun pinnalle. Immunofluoresenssikokeiden ja kvantitatiivisen analysoinnin perusteella endosytoosi estyi, vaikkakin ero kontrollisoluihin oli ainoastaan 10 %. Lisäksi toinen immunofluoresenssikoe osoitti, että EV1:n infektiivisyys laski käytettäessä PLC-inhibiittoria. Immunofluoresenssikokeissa ongelmia aiheuttivat tyhjät ja rikkinäiset viruspartikkelit, jotka havaittiin EV1:n karakterisoinnin aikana läpäisyelektronimikroskoopilla. Leimautuneet tyhjät ja rikkinäiset partikkelit aiheuttivat todennäköisesti väärää signaalia immunofluoresenssikokeissa, joiden perusteella voitiin todeta, että viruksen puhdistaminen ja leimaaminen vaativat lisää optimointia. Suora kapsidileima voisi onnistuessaan toimia työkaluna tulevissa viruksen avautumiskokeissa ja livetutkimuksissa, jolloin vasta-aineleimauksiin liittyvä taustafluoresenssi saataisiin minimoitua. Lisäksi PLC-inhibiittori voisi mahdollistaa viruksen avautumisen tutkimisen solun pinnalla endosomaalisten rakenteiden sijaan.