Monomerisaation vaikutus Deinococcus radioduransin fytokromiin - Linna, Marko (2014)
Fytokromit ovat yksi kolmesta fotomorfogeneesiä säätelevistä proteiiniperheistä. Niitä löytyy kasveista, bakteereista ja sienistä. Fytokromit reagoivat ympäristön muuttuviin valaistusolosuhteisiin, ja niiden tehtäviin kuuluvat muun muassa kasveilla siementen kehittymisen ja bakteereilla solusyklin säätely. Luonnossa fytokromi esiintyy homodimeerinä. Fytokromin perusrakenne koostuu kromoforin sisältävästä fotoreseptorialueesta sekä signalointialueesta, joka välittää tiedon valaistusolosuhteiden muuttumisesta solussa eteenpäin. Tässä tutkielmassa käytetyn Deinococcus radiodurans -bakteerin bakteerifytokromin fotoreseptorialueen runko rakentuu Per/Arndt/Sim (PAS) ja cGMP fosfodiesteraasi/adenyylisyklaasi/FhlA (GAF) -domeeneista, jotka muodostavat yhdessä kromoforin sitoutumistaskun sisältävän domeenin (cromophore binding domain, CBD). CBD:iin on kiinnittynyt tetrapyrroli biliverdiini. Fotoreseptorialueeseen kuuluu lisäksi fytokromiin liittyvä domeeni (phytochrome-specific domain, PHY), joka on kiinnittynyt GAF-osaan. Fotoreseptorialue on puolestaan liittynyt histidiinikinaasina toimivaan signalointialueeseen. Fytokromi toimii luonnossa kytkimenä, jolla on lepotila Pr ja valottunut tila Pfr. Valottuminen tapahtuu, kun Pr-tilaisen fytokromin tetrapyrroli absorboi punaista valoa. Tämän seurauksena tetrapyrrolin muoto muuttuu vaikuttaen samalla koko fytokromin laskostumiseen. Pfr-tilasta fytokromi palautuu takaisin Pr-tilaan joko absorboimalla pitempiä aallonpituuksia tai spontaanisti pimeäpalautumiseksi kutsutussa reaktiossa. Tutkimuksessa pyrittiin selvittämään vaikuttavatko monomerisaatio ja PHY-domeenin lisääminen CBD:n fysikaalisiin ja spektroskopisiin ominaisuuksiin. Tutkimusta varten tuotettiin sekä CBD:n että CBD-PHY:n dimeeri- ja monomeerimuotoa. Fytokromikonstruktit analysoitiin korkean erottelun nestekromatografia-kokoa erotteleva kromatografia -mittauksilla sekä UV-VIS -spektroskopialla. Saaduista tuloksista on havaittavissa, että CBD:n dimeeri- ja monomeerimuotojen välillä on merkittäviä fysikaalisia eroja. Korkean erottelun nestekromatografia-kokoa erotteleva kromatografia -mittausten tuloksista voidaan todeta, että monomeerimuodon laskostuminen Pfr -tilassa on mahdollisesti joustavampi kuin dimeerimuodon. Myös monomeerimuodon spektroskooppiset ominaisuudet poikkeavat dimeerimuodon ominaisuuksista. Monomeerimuoto valottuu dimeerimuotoa täydellisemmin Pfr-tilaan, ja pimeäpalautuminen on huomattavasti hitaampaa. PHY -domeenin lisäys CBD:iin muuttaa fytokromin spektroskopisia ominaisuuksia että stabiiliutta. CBD-PHY:n dimeeri- ja monomeerimuodot valottuivat CBD:tä paremmin Pfr-tilaan, ja etenkin monomeerimuodon pimeäpalautuminen on lähes täysin estynyt. Saadut tulokset osoittavat PHY -domeenin olevan kriittinen tekijä CBD:n stabiloinnissa. PHY-domeenin liittäminen CBD:n mahdollistaa viritystilan säilyttämisen, joka on tärkeää tutkittaessa mahdollisia käytännön sovelluksia. Esimerkki mahdollisista käytännön sovelluksista voisi olla punaisella aallonpituudella fluoresoivan proteiinin tuottaminen. Myös monomerisaatiolla on tärkeä rooli CBD:n eri konstruktien spektroskooppisessa käyttäytymisessä ja näin ollen voisi olla järkevää painottaa CBD:n monomeerikonstruktien tutkimusta.