Strongavidiini - biotiinia sitova merisiilestä peräisin oleva avidiinin kaltainen proteiini - Veneskoski, Katja (2009)
Biotiinia eli vitamiinia H suurimmalla luonnossa tavatulla ei-kovalenttisella affiniteetilla sitovaa avidiinia ja sen bakteeriperäistä sukulaisproteiinia streptavidiini käytetään laajasti erilaisissa avidiini-biotiini teknologian sovellutuksissa. Alun perin avidiini löydettiin kananmunan valkuaisesta ja sen rakenne on myöhemmin selvitetty tarkasti. Avidiinilla ja streptavidiinilla on monia hyödyllisiä ominaisuuksia. Avidiinin ja streptavidiinin on havaittu biotiiniin sitouduttuaan olevan erittäin stabiileja proteiineja, jotka kestävät hyvin mm. proteolyyttisiä entsyymejä ja ne omaavat voimakkaan lämmönkestävyyden. Yksi avidiini koostuu neljästä samanlaisesta monomeeristä, joista jokainen pystyy sitomaan yhden biotiinimolekyylin. Avidiinin ja streptavidiinin käyttämisessä on kuitenkin rajoituksia johtuen niiden farmakokineetikasta ja immunologisista ominaisuuksista. Näihin ongelmiin on pyritty löytämään vastauksia uusista avidiinin kaltaisista proteiineista, jotka ovat erilaisia mm. fysikaalisilta ja kemiallisilta ominaisuuksiltaan. Avidiniin kaltaisia proteiineja on löydetty mm. bakteereista, lintujen ja matelijoiden munista, merisiilestä sekä viimeisimmäksi sienestä. Näitä proteiineja vertailemalla on havaittu proteiinien olevan varsin konservatiivisia biotiinia sitovalta aminohapposekvenssinsä osalta. Proteiinien ominaisuuksia on tutkittu myös mutaatiolla, jolloin eri aminohapposekvenssejä on siirretty proteiinista toiseen. Näin on pystytty parantamaan monia avidiinin ominaisuuksia kuten esimerkiksi lämmönkestävyyttä, säilyttämällä samalla biotiininsitomiskyky. Tässä tutkimuksessa tutkittiin Strongylocentrotus purpuratus merisiilen genomista löydetyn geenin koodaaman avidiinin kaltaisen proteiinin, strongavidiinin, ominaisuuksia. Strongylocentrotus purpuratus merisiilestä peräisin olevasta viidestä geenistä ainoastaan yhtä onnistuttiin monistamaan ja sen proteiinia tuottamaan. Aikaisemmin merisiilestä löydettyjen fibropelliinien, jotka myös ovat avidiinin kaltaisia proteiineja, ei ole havaittu sitovan biotiinia. Strongavidiinin kuitenkin havaittiin sitovan voimakkaasti biotiinia. Strongavidiinia onnistuttiin tuottamaan E. coli bakteerissa ja puhdistamaan 2-iminobiotiinikolumnilla. Strongavidiinin havaittiin muistuttavan avidiinia rakenteeltaan sekä monilta ominaisuuksiltaan, kuten biotiinin sitomiskyvyltään. Biotiinin sitomiskyky varmistettiin ITC-mittauksilla (Isothermal titration calorimetry). Proteiinin muita ominaisuuksia tutkittiin SDS-PAGEn, ELISAn ja immunoblottauksen sekä Dot-blottauksen avulla. Strongavidiinin isoelektrisen pisteen voitiin havaita eroavan avidiinin ja streptavidiinin isoelektrisestä pisteestä. Erittäin matala isoelektrinen piste aiheutti mm. sen, että immunoblottausta ei saatu suoritettua strongavidiinille. Strongavidiinin matala isoelektrinen piste (3,91) näytti aiheuttavan monessa vaiheessa mittausongelmia. Lämpökäsitellyissä näytteissä biotiinin sitoutumisen strongavidiinin havaittiin nostavan strongavidiinin lämmönkestävyyttä. Sitoutumattomassa muodossaan lämmönkestävyys näytti heikommalta kuin avidiinin ja streptavidiinin lämmönkestävyys. Strongavidiinilla näyttää esiintyvän ristiinreagoimista avidiinin ja streptavidiinin vasta-aineiden kanssa Dot-bolttauksella suoritettuna sekä ELISA-mittauksissa. Strongavidiinilla on kolme kysteiinitähdettä ja kaksi näistä saattaa muodostaa monomeerien sisäisiä rikkisiltoja samalla tavoin kuin avidiinin monomeereissä. SDS-PAGElla ilman β-merkaptoetanolin pelkistävää vaikututusta suoritetuissa kokeissa, strongavidiini esiintyi osittain tetrameerisessä muodossa. Tämä viittaa siihen, että strongavidiini muodostaa myös alayksiköiden välisiä rikkisiltoja.