| Summary: | ZNF185 on yksi huonoimmin karakterisoiduista LIM-domeeni-proteiineista ja siitä löytyy ainoastaam 37 artikkelia, joista vain muutama keskittyy ZNF185:n solutoimintoihin. LIM-domeeni-proteiinit osallistuvat yleensä proteiinien välisiin vuorovaikutuksiin ja monet niistä on yhdistetty erityisesti solun tukirankana toimivaan aktiiniin. Tässä pro gradu -tutkielmassa selvitettiin ZNF185:n roolia soluissa inaktivoimalla ZNF185-geeni CRISPR/Cas9- menetelmän avulla. Geenin onnistunut inaktivointi varmennettiin sekä genomiettä proteiinitasolla ja yhteensä viidessä kloonissa ZNF185:n inaktivaatio oli täysin onnistunut. Näiden viiden kloonin lisäksi tunnistettiin joitain osittaisia poistoklooneja, jotka ilmensivät vain pienempiä ZNF185:n isoformeja. Perustuen U-2 OS-villityypissä tehtyihin ZNF185-vasta-ainevärjäyksiin ja eksogeenisesti ilmennettyyn ZNF185:een, sen solunsisäinen sijainti pystyttiin määrittämään dorsaalisiin stressisäikeisiin sekä myös heikosti ventraalisiin stressisäikeisiin. ZNF185-poistogeenisten kloonien vasta-ainevärjäyksissä dorsaaliset stressisäikeet olivat himmeitä tai puuttuivat kokonaan, mikä sopii hyvin yhteen ZNF185:n solunsisäisen sijainnin kanssa. Lisäksi vasta-ainevärjäykset paljastivat, että solujen fokaaliadheesiot olivat morfologialtaan pidemmät ja kooltaan suuremmat verrattuna villityypin solujen adheesioihin. ZNF185 inaktivaation seurauksena solut muodostivat myös epänormaalin pitkäikäisiä häntärakenteita. Lisäksi solujen etureuna oli epäsäännöllisen muotoinen. Poistogeenisten solukloonien suuntavaistoa sekä liikkumisnopeutta analysointiin satunnaisessa solun liikkumiskokeessa, ja tulosten mukaan kloonit olivat huomattavasti hitaampia kuin villityypin solut, mikä voisi johtua suuremmista fokaaliadheesioista. ZNF185:n poistamisella ei kuitenkaan ollut suurta vaikutusta solujen suuntavaistoon. Myös RhoA-aktiivisuus mitattiin poistogeenisistä klooneista ja villityypin soluista aikaisemman tutkimuksen varmentamiseksi, mutta näytteiden välillä ei ollut suuria eroavaisuuksia. Kaikki kerätty data viittaisi siihen, että ZNF185:n poistamisen seurauksena solukuori on heikko tai häiriintynyt rakenteeltaan, ja poistogeeniset kloonit yrittävät kompensoida sitä epäjärjestäytyneillä stressisäikeillä. ZNF185:n on aikaisemmin liitetty eri syöpätyyppeihin, esim. keuhkosyöpään. Se voisikin mahdollisesti olla biomarkkeri, minkä takia jatkossa onkin tärkeää tutkia tarkemmin ZNF185:n roolia stressisäiedynamiikoissa.
ZNF185 is one of the poorly characterized LIM-domain proteins with only 37 articles in Pubmed.org, just a few of them focusing on the cellular functions. LIM domain proteins typically facilitate protein-protein interactions that are involved in diverse cellular functions, which are often associated with the actin cytoskeleton. The role of ZNF185 was investigated further in this master’s thesis by inactivating the ZNF185 gene in U-2 OS cells using CRISPR/Cas9-method. The successful knockout of ZNF185 was validated at the genomic as well as the protein level and all together five complete knockouts were identified. In addition to the complete knockout clones, some so-called partial knockout clones were identified that were expressing only smaller isoforms. Based on antiZNF185 stainings and exogenously expressed ZNF185 in U-2 OS wild-type cells, the subcellular localization of ZNF185 was determined mostly in the dorsal stress fibers and weakly to the ventral stress fibers. The immunofluorescence images of ZNF185 knockout clones revealed that the focal adhesions were elongated and larger compared to the wild-type cells. The dorsal stress fibers were faint or missing, which is in line with the subcellular localization of ZNF185. Moreover, the knockout cells formed tail structures which they could not retrack and they had irregular leading edge. This could indicate that there are cytoskeletal defects because of the loss of ZNF185 and the cell does not support the cell shape as it should. In the random cell migration assay, the speed of knockout cells was significantly slower, presumably due to the larger focal adhesions that take longer to disassemble. Nevertheless, the loss of ZNF185 had relatively small or non-significant effects on the directionality. The RhoA activity was measured in the knockout cells and wild-type cells to validate earlier studies, and it had no significant differences between the knockout cells and the wild-type. All in all, this data indicates that the ZNF185 deficient cells are under a lot of tension due to disordered cell cortex, and the knockout cells tried to compensate causing also the disheveled stress fibers. More studies must be done to research the specific role ZNF185 might have in the regulation of the actin cytoskeleton and focal adhesions because ZNF185 has a potential to be a biomarker for different types of cancer.
|
|---|