| Summary: | Optogenetiikka on tekniikka, jossa geeniteknologia yhdistettynä valokontrolliin mahdollistaa biologisten prosessien ajallisesti ja paikallisesti tarkan säätelyn. Optogeneettisissä sovelluksissa hyödynnetään valoaktiivisia proteiineja, kuten fytokromeja, solun toimintojen manipuloimiseksi. Optogeneettisillä työkaluilla valolla voidaan hallita esimerkiksi geenien ilmentämistä bakteereissa tai nisäkkäissä. Potentiaalisia käyttökohteita bakteereissa ovat muuan muassa synteettinen biologia ja biomateriaalien tuotannon sekä metabolisten prosessien tehostaminen, nisäkässoluissa taas erityisesti lääketieteelliset sovellukset. In vivo -kokeita ja nisäkässolusovelluksia ajatellen kiinnostavia ovat punaisen/kaukopunaisen valon aallonpituuksilla hallittavat työkalut, jotka ovat soluille turvallisempia ja mahdollistavat valon pääsyn syvemmälle kudoksiin. pREDusk on punaista valoa aistivaan bakteerifytokromiin perustuva työkalu halutun geenin ilmentämisen säätelyyn bakteereissa. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli löytää pREDusk-työkalun toiminnalle tärkeät promoottorialueen osat ja sekvenssielementit ja lyhentää promoottorialuetta mahdollisia tulevia nisäkässolusovelluksia varten. Hypoteesina oli, että alkuperäistä lyhyempi alue riittää takaamaan toiminnan bakteereissa. Promoottorialueesta valmistettiin mutageneesillä lyhennettyjä variantteja, joihin sisällytettiin erilaisia yhdistelmiä transkription aloitukselle aiemmin tärkeiksi tunnistetuista sitoutumiskohdista ja muista promoottorisekvenssin elementeistä. Varianttien toimintatehokkuutta bakteereissa arvioitiin fluoresenssimittauksilla. Työkalun havaittiin säilyttävän toimintansa bakteereissa myös lyhennettynä versiona. Työn tärkeimpänä tuloksena tunnistettiin promoottorialueen sekvenssielementit, jotka ovat tärkeitä työkalun toiminnalle bakteereissa. Tuloksia voidaan hyödyntää tulevissa tutkimuksissa, joiden myötä pREDusk-työkalun potentiaali voidaan siirtää käytännön sovelluksiin.
Optogenetics is a technique combining genetic engineering and light-based control to regulate biological processes with high precision. By utilising light-sensitive proteins, e. g. phytochromes, optogenetic applications allow manipulating cellular activities such as gene expression by light in both prokaryotes and eukaryotes. Potential optogenetic applications for bacterial use are for example developing synthetic genetic circuits and controlled production of metabolites and biofuels. In mammalian use, optogenetic tools have potential for various therapeutic applications. Interesting tools considering in vivo mammalian applications are ones sensitive to red/far-red light which is less phototoxic and enables deeper tissue penetration compared to shorter wavelengths. pREDusk is an optogenetic tool based on a red light-absorbing bacteriophytochrome for controlling bacterial gene expression. The aim of this study was to identify the essential promoter sequence elements for the tool´s function in bacteria and consider the potential of a shortened sequence for mammalian applications. Hypothesis was that a shortened promoter area would be sufficient for function in bacteria. Promoter variants with different combinations of previously determined binding sites and other sequence elements were created by mutagenesis, and their functionality in bacteria was assessed by measuring target protein fluorescence. A shortened variant with effective function was created successfully, and sequence elements essential for function in bacteria were located and identified. The results can benefit future studies, through which the potential of the pREDusk tool can be transferred to practical applications.
|
|---|