| Summary: | Antibiooteille vastustuskykyisten bakteerien yleistyminen on noussut yhdeksi suurimmista maailmanlaajuisista terveysongelmista. Se on aikaansaanut tarpeen katsoa perinteisten hoitomenetelmien ulkopuolelle ja kehittää uusia menetelmiä vastustuskykyisiä bakteeri-infektioita vastaan. Faagiterapia eli bakteerien omien virusten käyttäminen isäntäspesifisesti infektioita vastaan on yksi lupaavimmista menetelmistä. Tämän tutkielman tavoitteena oli selvittää, miten limakalvoympäristö vaikuttaa faagiresistenssin syntyyn Pseudomonas aeruginosa PA14 -bakteereissa ja miten syntynyt resistenssi vaikuttaa bakteerien virulenssiin. Lisätavoitteena oli selvittää musiinin vaikutusta PA14-bakteerien biofilmimuodostukseen. Resistenssikehitykselle optimaalisimmat ravinneolosuhteet ja aikajana määritettiin kasvuanalyysillä ja faagiresistentit PA14-bakteerit tuotettiin kasvattamalla bakteereita faagien DMS3vir ja GEC-PNG14 ollessa läsnä. Resistenssimekanismeja vertailtiin spot-on-spot testillä sekä CRISPR PCR -kokeella. Lopuksi vastustuskykyisten bakteereiden virulenssi testattiin soluviljelymallilla hyödyntäen ihmisen keuhkosolulinjan A549-soluja. Musiinin odotettiin edistävän DMS3vir-resistenssin syntyä CRISPR-järjestelmän kautta, kun muutoin pintamodifikaatio olisi yleisempää. GEC-PNG14 oletettiin indusoivan resistenssiä vain pintamodifikaation kautta sen anti-CRISPR-ominaisuuksien ansiosta. Resistenssin odotettiin laskevan bakteerien virulenssia riippumatta mekanismista. Musiini edisti faagiresistenssikehitystä ja alensi bakteerien biofilmimuodostuskykyä, mutta ei vaikuttanut resistenssi-mekanismeihin. Resistenttien bakteerien virulenssi oli kuitenkin merkittävästi matalampi kuin villityypin bakteereilla. CRISPR-puolustuksen puutoksen syyt eivät selvinneet tässä tutkielmassa, mutta järjestelmä saattoi vain esimerkiksi olla epäsuotuisa pintamodifikaatioon verrattuna faagi-isäntä- ja ympäristötekijöiden takia. Virulenssimuutokset johtuivat luultavimmin pintamodifikaatioista, kun bakteerit muokkasivat solukalvon reseptoreitaan saavuttaakseen resistenttiyden. Viimeisimpänä, biofilmimuodostuksen muutokset johtuivat luultavimmin musiinin kyvystä edistää bakteerien liikehdintää.
The rise of antibiotic resistance in bacteria is one of the severest global health hazards, forcing us to investigate novel treatment methods against resistant pathogens. Phage therapy, the use of bacterial viruses to selectively kill their hosts, is among the most feasible of the alternatives. This thesis aimed to determine how a mucous environment, simulated with mucin, effects phage resistance development in Pseudomonas aeruginosa PA14, and how said resistance affects bacterial virulence. Additionally, how mucin affects PA14 biofilm formation was assessed. A growth rate analysis was first used to assess the best nutrient conditions and timescale for phage resistance generation. Next, phage resistant PA14 were produced in an evolution experiment using two phages: DMS3vir and GEC-PNG14. Resistance mechanisms were evaluated using a spot-on-spot assay and CRISPR PCR. Lastly, virulence changes caused by resistance generation were quantified by cell viability assays utilizing human A549 cells. Mucin was expected to promote resistance to DMS3vir through the CRISPR system while surface modification would reign in its absence. GEC-PGN14 was expected to induce resistance only through surface modification due to its anti-CRISPR capabilities. The virulence of the resistant mutants was expected to be lowered compared to wild type bacteria regardless of the type of resistance. Mucin was also expected to increase biofilm production in PA14. Ultimately, mucin promoted phage resistance generation and inhibited biofilm formation, but did not influence the phage resistance mechanisms. Phage resistant mutants had a significantly lowered virulence compared to wild type bacteria. The reason for the lack of CRISPR defences was not identified, although the system might just have been costly compared to surface modification due to phage-host and environmental characteristics. The observed virulence changes may have stemmed from changes in motility and interaction capabilities, with surface mutants sacrificing cell surface receptors in exchange for resistance. Lastly, changes in biofilm formation resulted probably from mucin promoting twitching motility in PA14.
|
|---|